中国科学家实现以RNA为媒介的基因精准写入

中国科学家实现以RNA为媒介的基因精准写入 以CRISPR基因编辑技术为代表的技术进步实现了基因组单碱基和短序列尺度的精准编辑，基本解决了基因组精准编辑的挑战。然而，如何针对应用场景的需求，实现大片段DNA在基因组的高效精准整合，仍然是整个基因工程领域亟需突破的难题。该技术的突破意味着可以通过外源功能基因的精准写入，来干预多种不同位点基因突变导致的单基因遗传缺陷等疾病，从而开发更为通用的基因与细胞疗法，具有广泛的应用前景。针对这一重大技术挑战，多种基因写入技术已被开发，如CRISPR核酸酶介导的同源重组或非同源末端连接技术等，但是这些技术都依赖于DNA模板作为基因写入的供体（donor）。在实际医学应用中，DNA供体面临免疫原性高、在体（in vivo）递送困难、在基因组中具有随机整合风险等诸多挑战。相比之下，RNA供体具有免疫原性低、可被非病毒载体（例如LNP）有效递送、在细胞内迅速降解，无随机整合风险等特点，能有效应对DNA供体所面临的挑战。因此，以RNA为供体的大片段精准写入技术，在安全性、可递送性方面都具有显著的优势。然而，现有以RNA为供体的技术，要么无法实现>200 bp的DNA片段高效整合（如引导编辑等），要么依靠基因组随机整合从而带来基因组随机突变风险（如逆转录病毒等）。是否能够以RNA作为供体，实现功能基因尺度的大片段DNA基因组精准定点整合？仍然是基因工程领域面临的挑战。2024年7月8日，Cell杂志以长文形式在线发表了中国科学院动物研究所/北京干细胞与再生医学研究院李伟研究员与周琪研究员团队合作完成的题为All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons的研究论文。该研究结合基因组数据挖掘和大分子工程改造等手段，开发了使用RNA供体进行大片段基因精准写入的R2逆转座子工具，能够在多种哺乳动物细胞系、原代细胞中实现大片段基因（>1.5 kb）高效精准的整合，最高效率超过60%，成功实现了全RNA介导的功能基因（DNA）在多种哺乳动物基因组的精准写入，为新一代创新基因疗法的发展提供了基础。作为基因组进化的源动力之一，转座子可以通过在不同基因组间的"跳跃"，实现自我的复制与扩增。其中，以RNA作为媒介的R2逆转座子的"跳跃"机制与以RNA作为供体的基因写入工具的开发思路不谋而合。同时，该类逆转座子天然倾向于整合在真核生物固定的28S rDNA基因组位点，这一位点在人基因组中拷贝数目多（约219个），且远离蛋白编码基因，是适合于外源基因整合的安全港位点（"safe harbor"loci）。因此，R2逆转座子是以RNA为供体的大片段基因写入工具开发的有力的候选者。然而，尽管R2逆转座子早在上世纪80年代就被发现，其在哺乳动物细胞中的功能性质尚未被系统性地探索，迄今为止，未能被利用来在哺乳动物细胞中实现大片段功能基因的有效整合。在本研究中，研究团队首先通过数据挖掘，全面系统地分析了自然界中R2逆转座子元件的生物多样性；通过构建基于RNA供体的基因写入的报告体系，成功筛选出在哺乳动物细胞中具有完整GFP功能基因整合活性的R2Tg系统（来源于一种鸟Taeniopygia guttata 的基因组）。随后，研究团队针对R2Tg系统发挥功能所必需的两个关键组分：R2蛋白质以及供体RNA，进行了系统性的功能探索与工程化改造，最终获得了在人细胞系中基因整合效率超过20%的en-R2Tg工具。系统的工程化改造获得en-R2Tg工具由于R2蛋白质可以通过mRNA表达，且供体RNA本身也是RNA，那么，en-R2Tg工具能否以全RNA形式介导的基因的高效精准写入？为了探究这一点，研究人员通过体外合成获得了编码R2蛋白质mRNA以及供体RNA，并使用脂质体递送的方式将两条mRNA导入人的细胞中。结果显示，en-R2Tg工具能够高效整合多个与疾病治疗相关基因，且这些基因能够有效表达功能蛋白。能够以全RNA的形式发挥功能，意味着en-R2Tg工具可以使用安全性已经在临床上得到证明的LNP纳米材料来进行递送，这将有可能解决长久以来基因写入工具依赖病毒载体进行高效递送的难题。研究团队发现，使用LNP递送en-R2Tg工具在人的肝脏细胞系中能够实现25%的基因整合效率。此外，研究团队还证明R2工具在人类原代细胞中同样具有活性；同时，通过显微注射将en-R2Tg工具导入小鼠胚胎，成功实现了超过60%的GFP基因定点整合效率。本研究的另一关键点在于，工程化改造的en-R2Tg工具是否还保留有天然R2逆转座子的28S rDNA位点特异性整合这一性质？为了回答这一问题，研究人员结合无偏好的基因整合富集高通量测序以及全基因组三代测序方法，发现en-R2Tg工具在全基因组范围内展现了极高的基因整合特异性，大于99%的外源基因都精准整合到28S rDNA安全港位点。同时，结合qRT-PCR以及RNA-Seq实验，研究人员发现en-R2Tg工具对细胞的转录组状态几乎没有影响。这说明 en-R2Tg 介导的基因写入是位点精准特异的，可以有效避免逆转录病毒等技术所产生的基因随机整合导致的基因突变风险。综上，该研究基于自然界存在的R2逆转座系统，结合数据分析和工程化改造方法，成功开发了全RNA介导的、高效精准的基因写入技术，首次在多种人和小鼠细胞系及原代细胞中实现了功能基因的定点整合。R2基因精准写入工具在递送和安全性方面具有显著优势，未来有望基于此工具开发在体功能基因回补写入以及在体生成CAR-T细胞等全新的疾病治疗方法。值得注意的是，R2基因写入技术目前无法实现在不同基因组位点的可编程写入，且在人原代细胞中的基因写入效率较低，因此未来需要进一步发展和优化。开发全RNA介导的、高效精准的哺乳动物细胞大片段功能基因写入工具该研究由中国科学院动物研究所与北京干细胞与再生医学研究院合作完成，中国科学院动物研究所博士后陈阳灿、博士生骆胜球、博士后胡艳萍、博士生毛邦炜、王鑫阁与卢宗宝为本研究共同第一作者，中国科学院动物研究所李伟研究员与周琪研究员为共同通讯作者。该研究工作得到科学技术部、国家自然科学基金委员会、中国科学院、北京市自然科学基金等的大力支持。 ... PC版： 手机版：

科学家揭示对基因组健康至关重要的145个基因

科学家揭示对基因组健康至关重要的145个基因 2月14日，《自然》杂志发表了一项新研究，通过对近千个转基因小鼠品系进行系统筛选，发现了一百多个与DNA损伤有关的关键基因。这项工作为癌症进展和神经退行性疾病提供了见解，也为蛋白质抑制剂提供了潜在的治疗途径。基因组包含生物细胞内的所有基因和遗传物质。当基因组稳定时，细胞就能准确地复制和分裂，将正确的遗传信息传递给下一代细胞。尽管基因组非常重要，但人们对影响基因组稳定性、保护、修复和防止 DNA 损伤的遗传因素知之甚少。突破性研究及其影响在这项新研究中，威康-桑格研究所的研究人员与剑桥大学英国痴呆症研究所的合作者一起，着手更好地了解细胞健康的生物学特性，并找出维持基因组稳定性的关键基因。研究小组利用一组转基因小鼠品系，确定了 145 个在增加或减少异常微核结构的形成中起关键作用的基因。这些结构表明基因组不稳定和 DNA 损伤，是衰老和疾病的常见标志。当研究人员敲除DSCC1基因时，基因组不稳定性的增加最为显著，异常微核的形成增加了五倍。缺乏该基因的小鼠具有与人类凝聚素病症患者相似的特征，这进一步强调了这项研究与人类健康的相关性。通过 CRISPR 筛选，研究人员发现DSCC1缺失引发的这种效应可以通过抑制蛋白质 SIRT1 得到部分逆转。这些发现有助于揭示影响人类基因组一生健康和疾病发展的遗传因素。该研究的资深作者、剑桥大学英国痴呆症研究所的加布里埃尔-巴尔穆斯（Gabriel Balmus）教授说："继续探索基因组不稳定性对于开发针对遗传根源的定制治疗方法至关重要，其目标是改善各种疾病的治疗效果和患者的整体生活质量。我们的研究强调了SIRT抑制剂作为治疗粘连蛋白病和其他基因组疾病途径的潜力。它表明，早期干预，特别是针对 SIRT1 的干预，有助于在基因组不稳定性发展之前减轻与之相关的生物变化。"这项研究的第一作者、威康桑格研究所的大卫-亚当斯（David Adams）博士说："基因组稳定性是细胞健康的核心，影响着从癌症到神经变性等一系列疾病，但这一直是一个探索相对不足的研究领域。这项工作历时15年，体现了从大规模、无偏见的基因筛选中可以学到什么。所发现的 145 个基因，尤其是那些与人类疾病相关的基因，为开发治疗癌症和神经发育障碍等基因组不稳定疾病的新疗法提供了有希望的靶点。"研究要点：对基因组造成损害的各种来源包括辐射、化学接触以及 DNA 复制或修复过程中的错误。微核是一种小的异常结构，通常被称为"突变工厂"，其中含有错位的遗传物质，而这些物质本应在细胞核中。它们的存在意味着患癌症和发育障碍等疾病的风险增加。凝聚蛋白病是一组因凝聚蛋白功能障碍而导致的遗传病，凝聚蛋白对细胞分裂过程中染色体的正常组织和分离至关重要。这可能导致一系列发育异常、智力障碍、独特的面部特征和生长迟缓。当 SIRT1 蛋白被抑制时，DNA 损伤就会减少，它们就能挽救与内聚力破坏相关的DSCC1缺失所带来的负面影响。这种作用是通过恢复一种名为 SMC3 的蛋白质的化学水平实现的。编译来源：ScitechDaily ... PC版： 手机版：

科学家发现光合作用的原子级秘密

科学家发现光合作用的原子级秘密 了解光合蛋白质的生产论文的共同作者、研究小组组长迈克尔-韦伯斯特（Michael Webster）博士说："叶绿体基因的转录是制造光合蛋白的基本步骤，光合蛋白为植物提供生长所需的能量。我们希望通过更好地了解这一过程在详细的分子水平上能够帮助研究人员开发出光合作用更强的植物。这项工作最重要的成果是创建了一个有用的资源。研究人员可以下载我们的叶绿体聚合酶原子模型，并利用它提出自己关于叶绿体聚合酶如何发挥作用的假设，以及检验这些假设的实验策略。"光合作用是在叶绿体内进行的，叶绿体是植物细胞内的一个小区块，它含有自己的基因组，反映了叶绿体在被植物吞噬和合并之前曾是自由生活的光合细菌。看到植物叶绿体中转录光合基因的聚合酶分子。用电子显微镜收集到的单个分子图像经过分类和排列，揭示了蛋白质复合体结构架构的细节。资料来源：迈克尔-韦伯斯特和伊斯卡-普拉马尼克约翰-英纳斯中心的韦伯斯特小组研究植物如何制造光合蛋白，光合蛋白是实现这一优雅化学反应的分子机器，它将大气中的二氧化碳和水转化为单糖，并产生氧气作为副产品。蛋白质生产的第一阶段是转录，通过读取基因产生"信使RNA"。转录过程由一种名为 RNA 聚合酶的酶完成。叶绿体 RNA 聚合酶的复杂性50 年前，人们发现叶绿体中含有自己独特的 RNA 聚合酶。从那时起，科学家们就对这种酶的复杂程度感到惊讶。它比它的祖先细菌 RNA 聚合酶有更多的亚基，甚至比人类的 RNA 聚合酶还要大。韦伯斯特小组希望了解为什么叶绿体具有如此复杂的 RNA 聚合酶。为此，他们需要对叶绿体 RNA 聚合酶的结构构造进行可视化。研究小组使用一种称为低温电子显微镜（cryo-EM）的方法，对从白芥子植物中纯化的叶绿体RNA聚合酶样本进行成像。原子级分析的启示通过处理这些图像，他们建立了一个包含分子复合体中 5 万多个原子位置的模型。RNA 聚合酶复合体由 21 个亚基组成，分别在核基因组和叶绿体基因组中编码。研究人员对这一结构进行了仔细分析，从而开始解释这些元件的功能。这个模型让他们确定了一种蛋白质，它能在DNA转录过程中与DNA相互作用，并引导DNA进入酶的活性位点。另一种成分可以与正在产生的 mRNA 相互作用，从而在 mRNA 转化为蛋白质之前保护它不被蛋白质降解。韦伯斯特博士说："我们知道叶绿体 RNA 聚合酶的每一个组成部分都起着至关重要的作用，因为缺少其中任何一个组成部分的植物都不能制造光合蛋白质，因此也就不能变绿。我们正在仔细研究原子模型，以确定装配的 21 个组件中每个组件的作用。"第一作者Ángel Vergara-Cruces博士说："现在我们有了一个结构模型，下一步就是确认叶绿体转录蛋白的作用。通过揭示叶绿体转录的机制，我们的研究有助于深入了解叶绿体在植物生长、适应和应对环境条件中的作用。"共同第一作者伊斯卡-普拉马尼克（Ishika Pramanick）博士说："从极具挑战性的蛋白质纯化开始，到为这一巨大复杂的蛋白质拍摄令人惊叹的低温电子显微镜图像，再到最终看到我们的工作成果的印刷版本，在这一非凡的工作历程中有许多令人惊喜的时刻。"韦伯斯特博士总结道："高温、干旱和盐度限制了植物进行光合作用的能力。面对环境压力仍能可靠地生产光合蛋白的植物可能会以不同的方式控制叶绿体转录。我们期待看到我们的研究成果被用于开发更强健作物的重要工作中。"编译自:ScitechDaily ... PC版： 手机版：

科学家在人类体内发现全新类型的"生物实体"

科学家在人类体内发现全新类型的"生物实体" 我们随身携带的微生物组非常庞大，并且仍在了解有关其构成及其如何影响我们健康的新知识。我们时常会在微生物组中发现新的细菌或病毒菌株，但科学家很少会发现一组全新的、不属于任何已知类别的实体。斯坦福大学的研究小组称它们为"方尖碑"（Obelisks），这要归功于它们的杆状结构。前者我们都很熟悉，而病毒则是更简单的 RNA 分子，可以通过分解和重组基因组进行复制，但不产生蛋白质，也没有保护壳。方尖碑具有类病毒的基本结构，但与病毒一样，它们简单的基因组似乎也能编码科学家称之为"方尖碑蛋白"的未知蛋白质。事实证明，方尖碑非常常见，而且种类繁多，令人惊讶。科学家们从世界各地 400 多人的微生物组样本中发现了近 3 万种不同类型的方尖碑。在大约 50% 的口腔微生物组测试样本和 7% 的肠道样本中都发现了它们。迄今为止，它们似乎还没有被发现，因为它们看起来并不像我们所知道的其他任何东西。研究人员在论文中写道："我们发现，方尖碑形成了自己独特的系统发育群，与已知的生物制剂没有可检测到的序列或结构相似性。"它们在我们体内究竟做了什么，目前仍是一个谜。它们可能帮助宿主，也可能伤害宿主，宿主可能不是我们，而是以我们的身体为家的细菌或真菌。到目前为止，最主要的候选菌是存在于牙菌斑中的血链球菌。血链球菌生活在人类口腔中，是一组新描述的 RNA 实体的宿主。图片来源：英国卫生安全局/科学图片库研究人员说，这种易于培养的细菌物种将是进一步研究方尖碑的最佳起点。该研究尚未通过同行评审，但已作为预印本在bioRxiv 上发布。 ... PC版： 手机版：

中国专家揭示猴痘病毒DNA复制工作机制

中国专家揭示猴痘病毒DNA复制工作机制 中国专家在全世界首次揭示猴痘病毒DNA复制的工作机制，将为后续抗病毒药物的研发提供关键结构基础。 据《北京日报》星期四（2月8日）报道，中国医学科学院、中国科学院等在国际知名学术期刊《科学》杂志上发表这项研究成果。 猴痘是由猴痘病毒引起的人畜共患病毒性疾病，目前已造成9万2000余人感染，其基因组的复制主要由自身编码的全酶复合物完成，但该复合物的工作机制尚不明确。为此，中国科学院院士高福团队领衔开展了针对猴痘病毒DNA聚合酶全酶结构的新研究。 研究团队使用石墨烯网格制备了冷冻电子显微镜，首次解析了猴痘病毒聚合酶全酶复合物处于复制构象时的高分辨率三维结构，揭示了猴痘病毒DNA复制的工作机制与其具有可持续合成能力的作用模式。 团队称，研究成果极大地增进了对猴痘病毒基因组复制过程的了解，将为后续抗病毒药物的开发提供关键结构基础。 2024年2月8日 1:36 PM

中国科学家运用AI算法发现大量RNA病毒

中国科学家运用AI算法发现大量RNA病毒 中国科学家运用人工智能（AI）算法，发现了16万余种RNA病毒，有助于在疫情暴发时更快锁定潜在病原体。 据中新社报道，中山大学星期三（10月9日）晚发布消息，中山大学医学院施莽教授团队与阿里云李兆融团队在《细胞》（Cell）杂志发表论文，报告了全球范围的180个超群、16万余种RNA病毒的发现，大幅扩展全球RNA病毒的多样性。 据介绍，传统的病毒发现方法包括病毒分离和生命组学的生物信息学分析，高度依赖既有知识，面对RNA病毒这种高度分化、种类繁多且容易变异的病毒识别效率低。该研究团队开发的LucaProt人工智能算法能够对病毒和非病毒基因组序列深度学习，并在数据集中自主判断病毒序列。 利用这套算法，研究团队在来自全球生物环境样本的1万零487份RNA测序数据中发现了超过51万条病毒基因组，代表超过16万个潜在病毒种及180个RNA病毒超群。其中23个超群无法通过序列同源方法识别，被称为病毒圈的“暗物质”。 通过进一步分析，团队报告了迄今最长的RNA病毒基因组，长度达到4万7250个核苷酸；发现了超出以往认知的基因组结构，展现出RNA病毒基因组进化的灵活性；识别到多种病毒功能蛋白，特别是与细菌相关的功能蛋白，进一步表明还有更多类型的RNA噬菌体亟待探索；发现在南极底泥、深海热泉、活性污泥和盐碱滩等极端环境中，RNA病毒的数量和多样性仍然较高。 “人工智能的算法模型能够挖掘出我们之前忽略或根本不知道的病毒，这种能力在疾病防控和新病原的快速识别中尤为重要。特别是在疫情暴发时，人工智能的速度和精度可以帮助科学家更快地锁定潜在病原体。”施莽介绍说，研究显示病毒的多样性远超人类想象，人类目前所看到的仍是冰山一角，未来病毒分类体系可能会有大规模的调整。 #中国 #科学家 #病毒-电报频道- #娟姐新闻:@juanjienews